遺伝子工学に詳しい方に質問です。

Aという遺伝子の入ったベクターを持っているのですが、
そのAをタンデムにつなげて、
AAAAAAAAAというようなコンストラクトを作りたいです。
その場合に、どういう手順でやるのが最も手っ取り早いですか?
お金は幾らかかってもいいので、早い方法を教えて下さい。

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回答(4件)

id:heimao46 No.1

heimao46回答回数18ベストアンサー獲得回数02005/03/04 18:47:39

ポイント20pt

遺伝子の両端が切れるようなエンザイムでベクターをカット(現在のベクターに入れるのに用いたエンザイムなど)

→アガロースゲルで泳動して遺伝子部分だけを精製

→ライゲーション

→アガロースゲルで適当な長さにタンデム化したと思われる塩基数のものを精製

→ベクターにライゲーション

→大腸菌にトランスフォーム

→コロニーPCRで向きが揃っているものをひっかけてくる(目的の遺伝子の3’端からのセンスのみを入れたPCRではかからず、目的の遺伝子の3’端のセンスとと5’端アンチセンスを入れたものでのみPCRがかかる)

数打ちゃあたるの世界ですが、大規模にやれば相当数つながったやつも拾えるんじゃないでしょうか…

とにかく二日で拾えます。

いかがでしょうか。

id:match7

PCRして……みたいに考えていましたが、

単に制限酵素で切り出して、それだけでライゲーションするのは一つの方法ですね。

ただ、向きがばらばらになるのは、考えようによっては恐ろしくて、

9つタンデムだったら、2の9乗(割る2)通りになるんですよねー。

その中から唯一の通りとなると……

何個コロニー拾えばいいのか……

2005/03/04 20:26:52
id:KIYO No.2

KIYO回答回数9ベストアンサー獲得回数02005/03/04 21:32:29

ポイント20pt

URLはダミーです。1)の回答者さんからのコメントを読む限り、分子生物学手法

に通じてらっしゃるようなので、詳しい手順は省きます。

一つの方法として、例えば5’末にBamHI制限酵素サイト、3’末にBglII制限酵素サイト

を付加してPCRをかけてはいかがでしょう?

Step.1

クローニングベクターにBamHI-BglIIでインサートを挿入。向き確認→A1ベクター

Step.2

A1ベクターをBglIIで切断して、BamHI-BglIIのインサートを挿入。向き確認→A2ベクター

BamHIとBglIIの断片が同じですが、一度ligationされると認識配列と異なるので、BamHIやBglIIで再度切断されないことを利用しています。

9つタンデムということなら、A2からBamHI-BglIIで取り出した配列をA2のBglIIサイトに入れれば、4連続(A4)、さらに繰り返して8連続(A8)、そこにもう一つ付加すればよいのではないでしょうか?

遺伝子配列中にBamHIやBglIIのサイトがあると使えませんが、他にもこのように利用できる配列、例えばSalI-XhoIもあります。

id:match7

おお、確かにこの方法だといいですねえ。

ただ、制限酵素の組み合わせが限られるのが難点ですが。

(例えば、タンデムにつなぐ時のリンカーのアミノ酸を指定した時とか)

こういう組み合わせ一覧が出てるような書籍、あるいはHPって無いですか?

2005/03/04 22:11:32
id:blueberryjam No.3

blueberryjam回答回数128ベストアンサー獲得回数22005/03/04 22:56:02

ポイント20pt

http://www.neb.com/

New England Biolabs

『こういう組み合わせ一覧が出てるような書籍』

という意味では

New England Biolabsのカタログがいいと思いますよ。

id:match7

NEBに一覧は無いですよね?(ある?)

自分で逐一見て調べるということでしょうか?

NEBは確かに、カタログというより実験書になりますね。

2005/03/04 22:57:45
id:blueberryjam No.4

blueberryjam回答回数128ベストアンサー獲得回数22005/03/04 23:04:57

ポイント10pt

http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzym...

Restriction Endonucleases, New England Biolabs

Isoschizomers

というページで、認識配列の同じ制限酵素を調べることができますが、そういう意味ではなかったのでしょうか?

web siteでも閲覧出来るみたいですね。

とりあえず10ポイントお返ししておきます。

id:match7

おお、いつも紙媒体しか見たことなかったけど、

こんなホームページがあるんだーー。

ふむふむ。かなり参考になりました。

2005/03/08 00:03:42

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