PCR product をフェーノール/クロロホルム抽出とクロロホルム抽出の後にエタノール沈殿をして回収しようとしました。

PCR後に、アガロースゲルで目的DNAが増幅されているのは確認できていたのに、エタノール沈殿でDNAがでてきません。
どうすればうまくエタノール沈殿ができるでしょうか。
だれか教えてください。

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  • 登録:2005/07/05 13:03:43
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回答(2件)

id:fet-33 No.1

fet-33回答回数303ベストアンサー獲得回数02005/07/05 13:52:58

ポイント100pt

http://biochem2.umin.jp/contents/Manuals/manual18.html

�j�_(DNA)-1�E���{�����i�H�@�a�F�j

PCRでの増幅が確認できているのであれば、問題は

回収方法にあると予測されます。

フェノール/クロロホルム抽出の際、上澄みの回収で

境界の中間層まで取りすぎてはいないでしょうか。

私もよく、限界への挑戦と題して境界ギリギリまで

取り除いたりしていましたが、同じく回収率が悪かった

という経験があります。

また、エタノール沈殿ですが、遠心後に本来ある筈のチューブ内壁とは

思いもよらない方向にペレットが張り付くことがあります。

「あれ!DNA消えちゃったよ!」

と思ってよくよく(しつこく)観察したら、実は

ちょっと離れたところにペレットと解らないような形で

ペッタリくっついていることもあります。丸い粒状ではなく

内壁に帯状(フタからチューブの底にかけて)にうっすらと

張り付いていることもあります。

 

操作法の基本的な回答で申し訳ありませんが、経験上、

PCRで増幅が確認されていれば、あとはやはり回収時の操作がポイントだと思います。

自分では全く同じ操作をしているつもりでも、再度やってみると

あっけなく成功したりすることもあります。

頑張って下さい。

id:AAAaaa

ありがとうございます!!

たしかに、境界ぎりぎりまで水層をとっていました。

もう一度チャレンジしてみます。

2005/07/05 15:12:04
id:hiropiro72 No.2

hiropiro72回答回数10ベストアンサー獲得回数02005/07/05 14:13:57

ポイント100pt

http://biochem2.umin.jp/contents/manualindex_j.html

���{�}�j���A��

1. エタノール沈殿の前に、塩(酢酸ナトリウム、グリコーゲンなど)を加えてイソプロパノール沈殿を行う。


2. エタノールを加えた後、-20~-80℃で冷やしてから遠心する。


私が答えられるのはこんなトコです。


実験がんばって下さい☆

id:AAAaaa

ありがとうございます。

−20℃に冷やしてみてもう一度やってみます。

2005/07/05 20:17:29
  • id:komyaaan
    PCR産物が小さい場合

    PCR産物が小さくなればなるほど、エタ沈は難しくなります。
    (DNA量が少なくなるためだと思ってます)
    エタチンメイトやゲノムなど共沈物質を使われるのもいいかもしれません
  • id:forget-me-not
    エッペンチューブ

    普通のエッペンチューブじゃなくて、平底チューブを使うのも一つの手段ですな。
  • id:AAAaaa
    Re:PCR産物が小さい場合

    なるほど、そうなんですか。
    そういうことを意識しながらやってきたいと思います。
    ちなみに、前回は47merのものでした。
    小さいPCR産物というのは、どれくらいのものからなのでしょうか・・・。

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