ある人工基盤の上での、骨芽細胞の増殖性、接着性について検討しております。

細胞数はMTT assay、骨生成活性はALP assayで評価しています。

しかし最近、細胞の死骸にもALP活性があるのでは、という疑惑が浮上しました。
そのため、細胞が全滅した状態でのALP assayを行いたいと思っているのですが、どのようにすれば「細胞が全滅した」と判定できるのかが分からずにいます。
そこで、以下の疑問点についてなにか有用な情報がありましたら教えてください。

・MTT活性が0ならば細胞が全滅しており、逆に0でなければまだ生存細胞がいると断定できるのか。(細胞の死骸にはMTT活性が全くないのか)

・死んだ細胞はALP活性が全くないのか。

・上記の疑問は細胞の死因(アポトーシスかネクローシスか)で答えが変わるものなのか。

・細胞が全滅していることを確認する手法が、顕微鏡などでの視認以外にあるのか。

すべての疑問点にお答えいただく必要はありません。
URLなしでも全くかまいません。

よろしくお願いいたします。

回答の条件
  • 1人2回まで
  • 登録:2008/05/02 14:40:27
  • 終了:2008/05/06 12:12:25

ベストアンサー

id:kappagold No.1

kappagold回答回数2710ベストアンサー獲得回数2482008/05/02 19:23:06

ポイント60pt

MTT・

>MTT活性が0ならば細胞が全滅しており、逆に0でなければまだ生存細胞がいると断定できるのか。(細胞の死骸にはMTT活性が全くないのか)

MTTアッセイは、信用してください。ミトコンドリアの呼吸に関係しています。死んでいれば、呼吸はしないし、生きていれば呼吸をすることから生死の判定に向いています。

ただ、細胞実験ですので多少の誤差もないとは言えません。99.9%死滅で0.1%生存と出た時に、それを元に実験結果を出すかといわれれば、私ならしません。

MTT自身は水溶性で黄色の溶液ですが、図3のように脱水素酵素による反応によって、MTTとNADHの間に酸化還元反応が起こり、MTTがFormazanに還元され、NADHがNAD+に酸化されます。この脱水素酵素はミトコンドリアの呼吸鎖に関連する酵素で、細胞の健康状態の指標となります。細胞が元気な場合は酵素活性が高いのでFormazanへの還元が起こるが、細胞が弱っている場合はそれがあまり起こらず、細胞が死んでいる場合はほとんど起こらないといえます。

http://www.chem-station.com/yukitopics/hisyoku1.htm


>死んだ細胞はALP活性が全くないのか。

骨代謝の指標として見られるので、死んだ細胞はALP活性を持たないと考えてください。

最初から死んでいる細胞は全く関係在りませんが、最初生きていて途中で死んだ場合死ぬまでの間には当然ALPを生産したと思いますし、骨代謝促進物質を加えて死亡した場合、ALPを沢山放出してから、死亡している可能性もあります。

その場合、生細胞に活性がオンされて計算されることになりますが、このあたりを詳しく調べていくと大変な事になります。ALPは、あくまで骨代謝の指標と考えて、あまり気にしない方が良いかと・・・・。


>上記の疑問は細胞の死因(アポトーシスかネクローシスか)で答えが変わるものなのか。

上記とかぶりますが、死んだ後は関係ないので、死因より、死亡に至るまでの過程が重要です。

id:Mad-Tanuki

ありがとうございます。

MTTのブレが数%~と多く、初学者のため何が問題か分からずにいました。

とにかく、MTTは信じることにして、別の方向から考えていきます。

2008/05/06 12:11:53
  • id:kappagold
    言葉が足りませんでした。

    99.9%死滅で0.1%生存と出た時に、それを元に実験結果を出すかといわれれば、私ならしません。

    100%死んでいる可能性もあると考えますし、0.2%生存かも知れないし、ましてや得られた活性値を、0.1%の生細胞によるものと結論付けたりはしないというような意味です。

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