【免疫染色】

この度はじめて免疫染色を試みようとしておりますが、抗体の選定で不明な点があるため質問いたします。

一次抗体にマウスIgG1を使用する場合、二次抗体として抗IgG抗体を使用することはできるのでしょうか。
(一次抗体のサブクラスを気にする必要はあるのでしょうか)

端的に申し上げますと、
一次抗体 http://url.ms/Aw8
二次抗体 http://url.ms/Aw9
この組み合わせで使用することは可能でしょうか。

よろしくお願い致します。

回答の条件
  • 1人3回まで
  • 登録:2008/10/22 18:15:01
  • 終了:2008/10/23 17:57:17

ベストアンサー

id:kappagold No.1

kappagold回答回数2710ベストアンサー獲得回数2482008/10/22 21:50:21

ポイント100pt

普通は反応します。

通常、IgG抗体でマウスIgG1を認識しないものであれば、カタログに注意書きやら説明などがあるはずですので、理論的には行くと考えられますが、使用例を見つけることが出来ないので、100%とはいえません。


質問の組み合わせですと、FITCになると思うのですが、

F7053のFITCがついている抗ビンキュリンモノクローナル抗体を使うというのは、どうですか。(以下、pdfの最終ページの製品)

http://www.sigma-aldrich.co.jp/sigma/cell/ECM/List_PDF/061212_ki...

id:Mad-Tanuki

ありがとうございます。

 

ご提示いただいた抗体ですが、用途がCytoになっているのが気になります。

私の用途は細胞の蛍光観察なのですが、先日、免疫染色の経験者とお話をする機会があり、

用途が「IHC」となっている抗体を使えば間違いない、と聞いているのです。

素人考えではCytoでいい気もするのですが、どうなのでしょうか。

もしよろしければもう一度「回答」していただけると幸いです。

 

わざわざ調べていただきありがとうございました。

2008/10/23 10:11:29

その他の回答(1件)

id:kappagold No.1

kappagold回答回数2710ベストアンサー獲得回数2482008/10/22 21:50:21ここでベストアンサー

ポイント100pt

普通は反応します。

通常、IgG抗体でマウスIgG1を認識しないものであれば、カタログに注意書きやら説明などがあるはずですので、理論的には行くと考えられますが、使用例を見つけることが出来ないので、100%とはいえません。


質問の組み合わせですと、FITCになると思うのですが、

F7053のFITCがついている抗ビンキュリンモノクローナル抗体を使うというのは、どうですか。(以下、pdfの最終ページの製品)

http://www.sigma-aldrich.co.jp/sigma/cell/ECM/List_PDF/061212_ki...

id:Mad-Tanuki

ありがとうございます。

 

ご提示いただいた抗体ですが、用途がCytoになっているのが気になります。

私の用途は細胞の蛍光観察なのですが、先日、免疫染色の経験者とお話をする機会があり、

用途が「IHC」となっている抗体を使えば間違いない、と聞いているのです。

素人考えではCytoでいい気もするのですが、どうなのでしょうか。

もしよろしければもう一度「回答」していただけると幸いです。

 

わざわざ調べていただきありがとうございました。

2008/10/23 10:11:29
id:idetky No.2

idetky回答回数426ベストアンサー獲得回数202008/10/23 09:22:59

ポイント100pt

結論を言いますと、見ることができる可能性は高いです。


この一次抗体のデータシートには、

Monoclonal Anti-Human Vinculin (mouse IgG1 isotype)

とかり、抗体のサブタイプはIgGであることが明記されており、

二次抗体のデータシートには、

Anti-Mouse IgG

とあり、この二次抗体はマウスのIgG抗体を認識するとわかるからです。

しかし、免疫染色などは、抗体により上手く染まる染まらないという癖があるため、100%確実に保障できるかどうかはわかりません。

そのため、基本的に上手く行くことがわかっている系(例えば、研究室の先輩や、知り合い、論文で発表されている)の抗体を利用して染めることになります。

また、免疫染色でしたら、二次抗体としてラビットIgGにFITCを結合させたものよりも、抗体を酵素で処理してFcを除いたFabやF(ab')2などをよく使います。

というのは、

1. 抗原認識に必要のないFcを除いて、抗体分子量を小さくすることで組織浸透度が高まる

2.組織中に、Fcレセプターとかケラチンなど、Fcと結合性のをもつものがそんざいする

からです。

id:Mad-Tanuki

ありがとうございます。

 

二次抗体のサイズは小さいほうがいいと小耳に挟んでいたのですが、なにぶん初めてなのでなるべく当たり前の方法をまず試そうと思っていました。

しかし、おっしゃるようにFabなどが良く使われているのであれば、そちらを検討しようと思います。

例えば、(http://url.ms/Azn)このような抗体を使用すれば良いということでしょうか。

 

よろしければもう一度「回答」していただけますと幸いです。

ありがとうございました。

2008/10/23 10:20:04
  • id:idetky
    ちなみに

    > 一次抗体にマウスIgG1を使用する場合、二次抗体として抗IgG抗体を使用することはできるのでしょうか。

    とありますが、
    IgG > IgG1(などのサブタイプ)
    なので、抗IgG抗体は大抵のサブタイプには反応します^^

    なぜなら、抗IgG抗体とあるばいには、正常マウス血清から、イオン交換カラムなどで様々なサブタイプが混ざり合った「バルクな状態」で精製してきた抗体を抗原として利用しているからです。


    おそら・・・くw
  • id:Mad-Tanuki
    idetky様

    わざわさありがとうございます。
    私の参照した実験書にはそのあたりまでの言及がなかったので困惑しておりました。
    これから「抗体科学」かなにかの本も読んでみようと思っております。
  • id:kappagold
    一次抗体 http://url.ms/Aw8
    の下のほうに、

    Wb:ウェスタンブロット FACS:フローサイトメトリー IP:免疫沈降 DB:ドットブトット Cyto:免疫細胞化学 IHC:免疫組織化学 IF:免疫蛍光法

    とあります通り、
    Cytoは細胞染色用、IHCは組織染色用と区別されているものと思っています。

    用途が細胞の蛍光観察であれば、Cytoの方が適していると思います。

    後、シグマ製品なので、電話で問合せをすれば、すぐに教えてくれると思いますよ。


    また、2次染色をするということであれば、製品は違いますが以下の論文では同じような実験をしていますので、ご参考下さい。
    http://www.jstage.jst.go.jp/article/jsssj/27/9/502/_pdf/-char/ja/
  • id:Mad-Tanuki
    kappagold様

    ありがとうございます。
    Cytoで良いということであれば、昨日ご提示いただきました抗体の利用を考えたいと思います。
    万が一うまくいかなかった場合、間接法ですとどちらの抗体が良くないのかすぐに分からないため、できれば直接法にしたいと元より考えていたのです。
    大変助かります。
    実験操作も参考にさせていただきます。
    わざわざ探していただきありがとうございました。

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