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PCR product をフェーノール/クロロホルム抽出とクロロホルム抽出の後にエタノール沈殿をして回収しようとしました。
PCR後に、アガロースゲルで目的DNAが増幅されているのは確認できていたのに、エタノール沈殿でDNAがでてきません。
どうすればうまくエタノール沈殿ができるでしょうか。
だれか教えてください。

●質問者: AAAaaa
●カテゴリ:学習・教育 科学・統計資料
✍キーワード:DNA PCR アガロース エタノール沈殿 クロロホルム
○ 状態 :終了
└ 回答数 : 2/2件

▽最新の回答へ

1 ● fet-33
●100ポイント

http://biochem2.umin.jp/contents/Manuals/manual18.html

?j?_(DNA)-1?E???{?????i?H?@?a?F?j

PCRでの増幅が確認できているのであれば、問題は

回収方法にあると予測されます。

フェノール/クロロホルム抽出の際、上澄みの回収で

境界の中間層まで取りすぎてはいないでしょうか。

私もよく、限界への挑戦と題して境界ギリギリまで

取り除いたりしていましたが、同じく回収率が悪かった

という経験があります。

また、エタノール沈殿ですが、遠心後に本来ある筈のチューブ内壁とは

思いもよらない方向にペレットが張り付くことがあります。

「あれ!DNA消えちゃったよ!」

と思ってよくよく(しつこく)観察したら、実は

ちょっと離れたところにペレットと解らないような形で

ペッタリくっついていることもあります。丸い粒状ではなく

内壁に帯状(フタからチューブの底にかけて)にうっすらと

張り付いていることもあります。

操作法の基本的な回答で申し訳ありませんが、経験上、

PCRで増幅が確認されていれば、あとはやはり回収時の操作がポイントだと思います。

自分では全く同じ操作をしているつもりでも、再度やってみると

あっけなく成功したりすることもあります。

頑張って下さい。

◎質問者からの返答

ありがとうございます!!

たしかに、境界ぎりぎりまで水層をとっていました。

もう一度チャレンジしてみます。


2 ● hiropiro72
●100ポイント

http://biochem2.umin.jp/contents/manualindex_j.html

???{?}?j???A??

1. エタノール沈殿の前に、塩(酢酸ナトリウム、グリコーゲンなど)を加えてイソプロパノール沈殿を行う。


2. エタノールを加えた後、-20?-80℃で冷やしてから遠心する。


私が答えられるのはこんなトコです。


実験がんばって下さい☆

◎質問者からの返答

ありがとうございます。

−20℃に冷やしてみてもう一度やってみます。

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