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タンパク質関連の質問です。エドマン分解を行ってN末端の配列を読んだ結果、全く未知のタンパク質でした。由来の菌はまだ全ゲノム配列が決定されていないため、まだ分かっていないものである可能性は十分にありえます。
今後の実験としてでのような事をやって行くのが妥当なのでしょうか?今考えているのは、このタンパク質の全アミノ酸配列を読む事なのですが、未知タンパク質である場合プライマーはどのように作成したらよいのでしょうか?
これ以外にやって意味がありそうな実験方針があったら教えてください。

●質問者: plp
●カテゴリ:医療・健康 科学・統計資料
✍キーワード:いもの アミノ酸 ゲノム タンパク質 プライマー
○ 状態 :終了
└ 回答数 : 5/5件

▽最新の回答へ

1 ● Insite
●20ポイント

http://www.hitachi-science.co.jp/products/bunseki/bio/proteome.h...

ある程度精製できるのなら、質量分析というアプローチもあります。少なくとも末端のアミノ酸配列は分かると思います。

MALDI-qQ-TOF?

解析器械は高価なので、学部に一台だけとか、大学に一台だけとか、なかったりします。このように外注サービスもあります。

◎質問者からの返答

なるほど、質量分析ですか。検討します。


2 ● KIYO
●20ポイント

http://bio.takara.co.jp/catalog/Catalog_d.asp?C_ID=C0189

カタログ : 3'-Full RACE Core Set

TaKaRaの3’RACE用Kitです。

全長がどの程度か分かりませんが、通常のPCRで伸長できる長さであればこれを使ってみるのはいかがでしょうか。


Forwardのプライマーですが、アミノ酸配列からコドンを推測するしか方法は無いと思います。その際、アルギニン・セリン・ロイシンのような対応するコドンが6つあるような配列をなるべく含まずにプライマーを設計してみてはいかがでしょうか。

http://www.gene.mie-u.ac.jp/Protocol/Original/Library-cDNA.html

cDNA Library

全長が長い場合3’RACEでは厳しいと思います。


対象となる菌の全ゲノム配列が決定されていないということになると、cDNA Libraryを作成してプラークハイブリダイゼーションによって目的のcDNA配列を持つクローンを得る方法が考えられます。


エドマン分解で得られたアミノ酸配列からcDNA配列を推測してプローブを作成するというのが考えられますが、エドマン分解の限界を考えるとプローブが短いかもしれません。


最初の方がおっしゃるように、質量分析で断片的にでもアミノ酸配列を決定しておくと良いかもしれません。

◎質問者からの返答

なるほど、丁寧な解説ありがとうございます。紹介していただいたリンクもかなり役立ちそうですね。となると、やはり、ゲノムライブラリー作成ですかね。


3 ● ryuzi_kambe
●20ポイント

http://www.riken.go.jp/r-world/info/release/press/2005/050630/

遺伝子発現情報(タイリングアレイ)で未知の遺伝子構造を推定

詳しい人に聞いたら、遺伝子発現情報(タイリングアレイ)で未知の遺伝子構造を推定する、というものがるそうです。データベース、プログラムともに公開されています。

http://omicspace.riken.jp/ARTADE/

Genome-Phenome Superbrain Project ARTADE

データベース、プログラムが公開されているページです。

◎質問者からの返答

これいいですね(^^)ありがとうございました。


4 ● s-k
●20ポイント

http://www.hatena.ne.jp/DAMMY/

読んだ配列を発現してN末の立体構造解析をしてみるとか。

◎質問者からの返答

なるほど。


5 ● brightonrock
●20ポイント

http://www.yahoo.co.jp/

Yahoo! JAPAN

URL:ダミーです。

エドマン分解で決定されたアミノ酸残基数にもよりますが、10アミノ酸程度では通常のBLAST searchで検索しただけでは相同性のある配列が見つからない可能性があります。その場合でも、E-valueの上限値を大きめにとってやれば類縁菌のorthologueが見つかる可能性があり、その情報からcDNA配列を予想する、あるいは、cDNAライブラリーないしはgenome DNAライブラリーのスクリーニングに有用なプローブとして利用することは可能です。

最終的に塩基配列の決定が目的であれば、MSを行っても、DNAライブラリーのスクリーニングは必須でしょうから、とりあえずの方法として試されてはいかがですか?

それでも相同性のある配列が見つからないのであれば、やはりMSなどでより多くのアミノ酸配列情報を得るほか無いでしょう。その後は100-200bpくらいの領域を増幅する縮重primerを設計してPCRを行い、得られた配列をもとにライブラリーをスクリーニングすることになります。このあたりは、PCRの実験参考書をご覧になればどれにも詳しく書かれております。

◎質問者からの返答

なるほど、参考になります。

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